肿瘤呼叫转移——肺癌篇
前言
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高。美国癌症学会发布的《2021全球癌症统计》报告[1]显示，肺癌是男性和女性死亡率排名第一的癌种。然而，大部分患者诊断时已是晚期，且肺癌晚期容易出现各个不同脏器的转移，可引起相应的症状，常常给病人带来极大的痛苦，甚至威胁到生命。与其他恶性肿瘤一样，肺癌扩散途径包括三种，一是淋巴道转移，二是血行转移，三是种植转移，肺癌最容易转移的6个部分分别是肝脏、大脑、肾上腺、骨、胸膜和淋巴结。例如肺癌脑转移，脑转移是肺癌常见的远处转移部位之一，也是让患者最为恐惧的转移部位，一旦肺癌患者出现脑转移，预后将变得极差，平均生存时间仅为1-2个月。肺癌脑转移的发生率在22％至54％之间，包括脑实质转移和脑膜转移。非小细胞肺癌患者在病程中约有30%左右发生脑转移，其中以大细胞未分化癌和腺癌较多见，鳞癌次之，而小细胞肺癌脑转移率更高。肿瘤是由恶性细胞、免疫细胞和基质细胞组成的复杂混合体，具有瘤内异质性和瘤间异质性。肿瘤微环境当中包括了促进肿瘤转移和抑制肿瘤生长的各种信号因素，相互平衡互作以调控肿瘤生长和进化，肿瘤异质性以及复杂的肿瘤微环境使临床诊断和治疗变得棘手。单细胞测序技术的发展能够帮助我们突破传统Bulk测序的限制，提高检测的分辨率，实现在单个细胞层面分析其状态和功能，发现新的细胞亚型，揭示细胞异质性，监视疾病的动态发展过程，最终提高对组织、器官和生物复杂性的理解。目前，单细胞测序技术已广泛应用于神经生物学、种系传播、器官生长、癌症生物学等多个领域。
肺癌脑转移
脑膜转移患者脑脊液中肿瘤细胞（CSF-CTC）直接来源于肿瘤灶，其计数的变化也可直接反映患者的治疗反应和进展。脑脊液循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）具有重要的临床研究价值，CSF的细胞学分析仍是肺癌脑转移的金标准。但是CSF-CTCs的分子和转录组学特征至今未知，值得研究。Ruan等[2]从5例肺腺癌脑膜转移患者CSF样本和3例正常对照CSF样本中分离了单个CSF细胞（图1），共获得1,152个肺癌CSF-CTC和401个免疫细胞的高质量单细胞转录组数据。通过分析发现，CSF-CTC高表达上皮标记，增殖标记和肺起源相关基因，代谢活跃并富集细胞粘附相关信号通路，这些是肿瘤细胞得以存活和实现转移的关键。CSF-CTC表现出明显的异质性，并对这种异质性进行了定量分析。结果表明不同患者之间CSF-CTCs的异质性要强于同一患者内CSF-CTCs的异质性，这种异质性表现在细胞周期，间充质/干细胞特性以及癌-睾丸抗原特性（图2）。另外，文章还测序并分析了一例原发灶不明转移癌（CUP）患者的448个CSF-CTC特性，分析了其诊断和疾病进展相关的标志物。该研究为肺癌脑转移的诊断治疗以及发生机制的相关研究提供一个新的视角，并为基于CSF-CTC转录组特征的数字PCR检测技术提供了候选基因。
图1 单细胞RNA实验流程与取样策略
图2 单细胞转录组数据通路分析、异质性分析
肺癌胸腔转移、淋巴结转移和脑转移
晚期转移性癌症给临床带来了最严峻的挑战，可能具有与早期癌症不同的分子和细胞特征。为了阐述LUAD发展的细胞动力学，Nayoung Kim等[3]对44例未经治疗的LUAD患者的原发性肺组织，胸腔积液和淋巴结转移或脑转移肿瘤组织，以及远端正常组织和淋巴结，进行单细胞转录组分析，共获得208,506个细胞，用经典的标记基因表达注释了9个细胞群：上皮细胞(肺泡细胞和癌细胞)、基质细胞(成纤维细胞和内皮细胞)、免疫细胞(T细胞、NK细胞、B细胞、髓样细胞和肥大细胞)为常见的细胞类型，而少突胶质细胞仅在脑转移中存在(mBrain)（图3）。
图3 LUAD患者的208,506个单细胞的聚类分群图
通过拟时轨迹分析发现，正常组织或早期至转移期癌症的细胞中，确定了一种偏离正常分化轨迹并主导转移期的癌细胞亚型（图4）。观察到一个（tS2）分别位于tS1和tS3分支的两端。与S2相关的基因显示出明显的肿瘤特征。tS1和tS3状态代表正常分化程序的失调，而tS2肿瘤细胞状态完全偏离正常转录程序。通过联合TCGA数据分析发现，tS2标记基因高表达的患者比低表达的患者表现出更差的总体生存率，而肺鳞状细胞癌（LUSC）则没有生存率差异，表明tS2信号明显参与LUAD进展（S2分支(TS2)上的癌细胞信号与LUAD患者的肺癌进展和转移特异性相关）。
图4 肿瘤和正常上皮细胞的转录轨迹
此外，该研究还发现正常的固有髓系细胞群逐渐被单核细胞来源的巨噬细胞和树突状细胞取代，同时出现T细胞耗竭。这种全面的单细胞分析增进了我们对转移性肺癌分子和细胞动力学的理解，并揭示了癌症-微环境相互作用中潜在的诊断和治疗靶点。肺癌脑转移、骨转移、肾上腺转移
正常组织再生的发育过程与癌症有关，但在肿瘤进展过程中和免疫监视的选择压力下，它们的差异程度仍不清楚，为了研究这个问题，Ashley M. Laughney等[4]从17个新鲜切除的人体组织样本中提取了40,505个独立细胞的转录组，包括非肿瘤肺(n = 4)、原发性肺腺癌(未治疗者7例，新辅助化疗后1例，脑转移瘤3例，骨转移瘤1例，肾上腺转移瘤1例）用于单细胞测序分析（图5），发现原发瘤中的细胞类型与转移瘤的细胞类型有明显差别，在原发瘤中，除了有正常肺组织中发育成熟的细胞外，还有两种发育“原始”的细胞，它们与组织再生有关。当肺部出现损伤，比如因为吸入油烟或抽烟，这两种分化程度较低的细胞会参与组织修复。而在转移瘤中，大部分细胞则退回到更原始的状态，也就是更接近胚胎发育时的干细胞特征。
图5 肺癌原发灶和转移灶细胞图谱
在肺部的各类细胞中，文章中还发现了2个对肺的发育非常重要的转录因子SOX2和SOX9（图6）。但在出生后，除了修复损伤的情况外，肺部很少还有细胞保留这两个转录因子的表达。然而，研究人员观察到，转移灶中刚启动生长的肿瘤细胞开启了SOX2的表达，更成熟的转移瘤则富含表达SOX9的细胞。进一步在转移性肺癌小鼠模型上的分析显示，这两种转录因子的表达关系到肿瘤细胞的存活与否。具体来说，开启SOX2的肿瘤细胞在分裂时，很容易被免疫系统中的自然杀伤（NK）细胞检测到，并被NK细胞摧毁。相反，打开了SOX9的癌细胞可以躲开NK细胞。换言之，转移的癌细胞显示了强大的可塑性，到达新地方后必须很快转变基因表达，才能抵挡免疫系统的追杀。
图6 肺发育和修复时涉及的关键上皮细胞类型和相关转录因子，SOX2和SOX9与特定类型的细胞发育有关
结语
肿瘤难治愈主要在于其异质性、转移性、免疫逃逸和肿瘤微环境，大约90%的癌症死亡不是由原发肿瘤引起，而是由转移引起的，虽然某些药物可以使得原发性肿瘤缩小转移，但目前没有直接实现治疗或预防转移的药物。没有靶向治疗，转移性肿瘤往往会再次出现。单细胞测序影响了肿瘤研究的许多领域，并提高了临床医师对肿瘤内异质性、肿瘤微环境、转移和治疗耐药性的认识。新格元秉持“格物致知，识微通元”的创新性理念，致力于发展简便可靠的单细胞组学技术，使之成为新一代细胞病理及血液检测手段，让单细胞组学以传统方法无法比拟的精确度、灵敏度和分辨率服务于精准医疗和健康管理等领域。
参考文献
[1] Siegel Rebecca L,Miller Kimberly D,Fuchs Hannah E et al. Cancer Statistics, 2021. [J] .CA Cancer J Clin, 2021, 71: 7-33
[2] Ruan H , Zhou Y , Shen J , et al. Circulating tumor cell characterization of lung cancer brain metastasis in the cerebrospinal fluid through single-cell transcriptome analysis. 2020.
[3] Kim N, Kim HK, Lee K, et al. Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma. Nat Commun. 2020;11(1):2285.
[4] Ashley M. Laughney., Hu, J., Campbell, N.R. et al. Regenerative lineages and immune-mediated pruning in lung cancer metastasis. Nat Med 26, 259–269 (2020)
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